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科研進展

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西南大學實時單細胞多模態《Lab on a Chip》期刊最新研究發表

發布時間:2024-07-24 作者:江蘇瑞明生物科技有限公司 點擊次數:369次

內容概要:


概述


西南大學余玲教授課題組在《Lab on a Chip》期刊發表最新研究成果“Probing the interaction between metastatic breast cancer cells and osteoblasts in a thread-based breast–bone co-culture device” ,研究組基于Col-I@thread的共培養模型模擬骨組織微環境,揭示癌細胞與骨組織間的串擾,為探索乳腺癌骨轉移的細胞和分子機制提供了平臺,并具有高通量篩選抗乳腺癌骨轉移藥物的潛力。研究中使用江蘇瑞明生物的實時單細胞多模態技術在該研究中用于檢測在Col-I@thread上生長的成骨細胞MC3T3-E1與2D培養板上生長的細胞的Ca2+分泌活性和礦化結節,表明在Col-I@thread上生長的細胞活性和骨基質形成更好。



背景&方案


乳腺癌對女性來說是一個潛在的巨大威脅,骨是晚期乳腺癌患者最常見的轉移部位,嚴重影響患者的生活。由于體外實驗有限,動物模型不合適,導致乳腺癌骨轉移患者缺乏有效的治療方法。在過去的幾十年里,微流控裝置因其良好的空間分辨率和構建細胞-細胞共培養室的潛力而在生物分析領域具有應用價值。近年來,基于線程的微流控技術作為微流控發展的一個分支,因其在纖維間形成的毛細結構而備受關注。


基于線程的細胞培養裝置的制作如下圖,(A)將凍干的Col-I@thread打結在聚氯乙烯(PVC)框架上進行細胞培養。(B)將兩塊thread@PVC框架堆疊起來組裝乳腺成骨細胞共培養模型。


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要點解析


01

為研究I型膠原修飾尼龍線(Col-I@thread)對細胞附著和增殖的影響,研究組使用不同方法制備了I型膠原修飾尼龍線(Col-I@thread),發現凍干方法制備的膠原修飾尼龍線能夠吸附更多的蛋白,圖1。同時,成骨MC3T3-E1細胞和乳腺癌4T1細胞在Col-I@thread上都有很高的粘附和增殖能力,并且相比于在2D細胞培養板上,絲線的三維結構更有利于細胞的附著和增殖,圖2。


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圖1 Col-I改性尼龍線的特征。(A) Col-I改性后尼龍線的SEM圖。(B)原始尼龍線,RT Col-I@thread和凍干Col-I@thread的C 1s的高分辨率XPS光譜。(C) BCA法定量測定尼龍線上的Col-I吸附。


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圖2.Col-I@thread上細胞的粘附和增殖。(A) MC3T3-E1細胞和4T1細胞MTT甲酸結晶紫圖像。(B) MTT增殖試驗量化MC3T3-E1和4T1的生長。*表示p<0.05,**p<0.01,**p<0.001。(C)培養14天后成骨細胞MC3T3-E1的骨骼染色共聚焦圖像。細胞核用DAPI核染料染色(藍色),微絲用Actin-Tracker標記(綠色)。


02

在Col-I@thread上生長的成骨細胞(MC3T3-E1)通過升高RUNX2、ALP、OPN和Col-I基因表達促進成骨細胞分化。實時單細胞多模態技術在該研究中用于在Col-I@thread上生長的成骨細胞MC3T3-E1與2D培養板上生長的細胞的Ca2+分泌活性和礦化結節檢測,表明在Col-I@thread上生長的細胞活性和骨基質形成更好。


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圖3 Col-I@thread和2D培養板上MC3T3-E1細胞的RNA-Seq分析。(A)差異表達基因火山圖。(B)豐富的KEGG通路注釋分類。Q值<0.05為顯著富集。(C)不同條件下細胞生長的Venn圖。(D) Venn圖交集基因的基因表達熱圖和KEGG通路圖。


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圖4 實時熒光定量PCR分析I型膠原(Col I) (A)、骨橋蛋白(OPN) (B)、矮子相關轉錄因子2 (RUNX2) (C)和堿性磷酸酶(ALP) (D)在GAPDH表達水平(作為內控)上的表達水平(Col-I@thread和2D培養板)。(E)相對基因表達熱圖。(F)上下游基因信號通路。


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圖5 在Col-I@thread上生長的細胞鈣代謝增加。(A)細胞培養板和Col-I@thread上MC3T3-E1細胞胞內鈣的熒光圖像。(B)納米探針檢測單個細胞內鈣離子的圖像。(C)單細胞多模態分析系統定量的鈣離子熒光強度(***表示p<0.001, n=10)。(D)茜素紅s染色的成骨細胞礦化結節(E)在Col-I@thread上培養3、7、14天的MC3T3-E1堿性磷酸酶(ALP)活性。*表示p<0.05,**p<0.01, n=5。(F)成骨細胞MC3T3-E1培養后抗拉強度試驗。(G) MC3T3-E1支撐成骨細胞7、14、30天后Col-I@thread的力學性能。*表示p<0.05,**p<0.01, n=5。


MC3T3-E1細胞分別在凍干的Col-I@thread和Col-I@2D培養板(對照)上培養7天和14天。隨后,用鈣熒光標記物Fluo–4 AM染色。檢測單細胞中鈣離子的熒光強度(激發波長)。實驗中使用實時單細胞多模態分析儀在熒光顯微鏡下觀察細胞,定位到檢測細胞,隨后操縱納米探針(100nm)緩慢地穿透細胞,定位至活細胞的細胞質部分,傳輸激發源(Ex:494nm),通過光信號采集系統(Em:516nm)收集單個活細胞內采集的鈣離子的熒光信號。每個實驗檢測10個細胞,計算平均熒光。


03

將Col-I@threads在指間交叉指框架中打結,組裝乳腺癌-骨共培養模型。研究證明,基于線程的共培養裝置使我們能夠分離浸潤性和非浸潤性乳腺癌細胞,并比較它們的分子特征。在骨轉移的乳腺癌細胞中,CX43、CXCR5和CSPG4基因的表達顯著升高。同時,RUNX2和OPG基因在成骨細胞中的表達受到抑制


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圖6 共聚焦顯微鏡圖像的成骨細胞(紅色)與乳腺癌細胞4T1(綠色)共培養使用線為基礎的設備。三維重建側視圖顯示4T1細胞侵入成骨細胞。



實時單細胞多模態分析儀


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1

實時單細胞多指標檢測:實時檢測單個活細胞內小分子含量(如葡萄糖、乳酸、ATP、膽固醇、Ca2+、K+等)及酶活性(葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、乳酸脫氫酶等),可匹配160余種商品化試劑盒;

2

實時亞細胞原位檢測:亞細胞水平(胞質、胞核、胞膜)實現實時連續、原位檢測;

3

超微量提取、注射:單細胞水平提取細胞器(如溶酶體、線粒體)、胞質進行質譜或其它平臺的聯用分析;單細胞注射藥物、代謝劑等,并進行藥效或機制評價;

4

活體水平檢測:活體水平實時檢測生化指標(用藥前后、中醫藥針灸刺激前后)的變化。


公司介紹
江蘇瑞明生物科技有限公司是一家集研發、生產、銷售精密生命科學儀器于一體的高新技術企業,也是無錫市政府重點引進的海外高層次人才創新創業企業。公司產品聚焦細胞領域,涵蓋細胞觀察、操作、分析、活體檢測及樣品前處理等多個方面,包括本文使用的實時單細胞多模態分析儀之外還有、活細胞智能監測系統、顯微操作系統、超微量提取注射儀、油壓注射器、開放式活體動物成像儀以及超微量芯片點樣儀等具體產品。


原文鏈接


Wu SM, Chen F, Yang XY, Wu TF, Sun W, Yu L. Probing the interaction between metastatic breast cancer cells and osteoblasts in a thread-based breast-bone co-culture device. Lab Chip. 2023 Jun 13;23(12):2838-2853. doi: 10.1039/d3lc00106g.

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